自動化多肽合成儀操作全流程解析：從樹脂選擇到產(chǎn)物純化的關(guān)鍵步驟
 

　　一、樹脂選擇：奠定合成基礎(chǔ)
 

　　樹脂是固相合成的核心載體，其類型直接影響多肽的溶脹性、疏水性及最終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。
 

　　聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂(Wang樹脂)
 

　　特點(diǎn)：網(wǎng)格空間大，適合長肽鏈合成；化學(xué)穩(wěn)定性高，可通過中等酸(如TFA)處理釋放多肽。
 

　　適用場景：常規(guī)多肽合成，尤其需C端羧酸結(jié)構(gòu)的多肽。
 

　　Rink Amide樹脂
 

　　特點(diǎn)：支持C端酰胺化，適合合成酰胺鍵結(jié)尾的多肽。
 

　　優(yōu)勢：兼容性廣，減少副反應(yīng)風(fēng)險。
 

　　PEG-PS樹脂
 

　　特點(diǎn)：溶脹性優(yōu)異，可降低空間位阻，提升疏水性多肽的合成效率。
 

　　案例：合成含連續(xù)疏水氨基酸(如Leu、Phe)的多肽時，PEG-PS樹脂可顯著提高粗純度。
 

　　選擇依據(jù)：根據(jù)目標(biāo)多肽的C端結(jié)構(gòu)(羧酸/酰胺)、序列長度及疏水性綜合評估。例如，含Cys、His等敏感氨基酸的多肽需選擇酸敏感性樹脂(如2-氯三甲苯樹脂)，以避免側(cè)鏈副反應(yīng)。
 

　　二、設(shè)備準(zhǔn)備與校準(zhǔn)：確保精準(zhǔn)控制
 

　　設(shè)備檢查
 

　　確認(rèn)溶劑儲液瓶、氣體管道連接完好，儀器各部件無損壞。
 

　　檢查壓力范圍：壓縮空氣(AIR)需在60-100psi，氮?dú)?N2)在5-10psi。
 

　　系統(tǒng)校準(zhǔn)
 

　　執(zhí)行溫度、條形碼、反應(yīng)器攪拌、取液針、氨基酸推瓶等測試。
 

　　校準(zhǔn)UV檢測模塊，確保脫保護(hù)效率監(jiān)測準(zhǔn)確。
 

　　反應(yīng)容器選擇
 

　　根據(jù)合成規(guī)模(如20-50μmol)選擇合適容器，避免溶劑與容器材料反應(yīng)。
 

　　案例：某實(shí)驗(yàn)室因未校準(zhǔn)UV模塊，導(dǎo)致脫保護(hù)效率監(jiān)測偏差，最終多肽缺失率達(dá)15%；校準(zhǔn)后缺失率降至3%。
 

　　三、合成步驟：脫保護(hù)、偶聯(lián)與洗滌的循環(huán)控制
 

　　樹脂溶脹與洗滌
 

　　用二氯甲烷(DCM)溶脹樹脂2小時，抽干后以DMF洗滌3次，去除雜質(zhì)。
 

　　脫保護(hù)
 

　　試劑：40%三氟乙酸/二氯甲烷溶液(含5% TIS作為清除劑)。
 

　　條件：室溫或50℃(含Asp序列需避免高溫，防止Aspartimide形成)。
 

　　監(jiān)測：通過UV檢測(290nm)確認(rèn)Fmoc完全脫除(吸光度下降≥95%)。
 

　　偶聯(lián)反應(yīng)
 

　　試劑活化：將氨基酸與HCTU/DIPEA(室溫15-30分鐘)或DIC/Oxyma(90℃下2分鐘)混合。
 

　　投料策略：
 

　　常規(guī)序列：5-7.5倍當(dāng)量氨基酸，分步補(bǔ)投(如初始5倍，UV監(jiān)測不足時追加2.5倍)。
 

　　困難序列(如連續(xù)Pro)：采用“加熱輔助+延長反應(yīng)時間”(50℃下2次，每次5分鐘)。
 

　　洗滌與封端
 

　　每步反應(yīng)后用DMF洗滌3次，清除未反應(yīng)試劑。
 

　　偶聯(lián)完成后進(jìn)行封端反應(yīng)(如用乙酸酐/DIPEA封閉未反應(yīng)氨基)。
 

　　數(shù)據(jù)支持：某抗菌肽合成中，通過優(yōu)化偶聯(lián)條件(5倍當(dāng)量+50℃加熱)，粗純度從66%提升至84%，試劑消耗降低30%。
 

　　四、裂解與粗肽收集：釋放目標(biāo)產(chǎn)物
 

　　裂解液配置
 

　　配方：95% TFA + 2.5% 水 + 2.5% TIS(清除劑)。
 

　　預(yù)冷至0℃后加入反應(yīng)釜，攪拌反應(yīng)2小時。
 

　　產(chǎn)物分離
 

　　裂解液經(jīng)濾膜抽濾，去除樹脂，并以TFA洗滌樹脂3次，合并濾液。
 

　　濃縮與沉淀
 

　　旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液至小體積，加入甲基叔丁基醚(MTBE)沉淀多肽。
 

　　離心(10,000rpm，10分鐘)收集沉淀，用冷乙醚洗滌3次，干燥得粗肽。
 

　　案例：某疫苗多肽合成中，通過優(yōu)化裂解時間(從3小時縮短至2小時)，產(chǎn)物回收率提升12%，且副產(chǎn)物減少。
 

　　五、純化與凍干：提升產(chǎn)物純度
 

　　高效液相色譜(HPLC)純化
 

　　條件：C18反相柱，流動相A(0.1% TFA/水)，流動相B(0.1% TFA/乙腈)。
 

　　梯度洗脫：0-30分鐘內(nèi)B相從10%升至60%，收集目標(biāo)峰。
 

　　凍干處理
 

　　將純化后的多肽溶液旋蒸濃縮，轉(zhuǎn)移至凍干瓶。
 

　　程序升溫：預(yù)凍至-80℃，真空度<50mTorr，升溫至25℃保持24小時。
 

　　數(shù)據(jù)支持：經(jīng)HPLC純化后，多肽純度從85%提升至98%；凍干后產(chǎn)物含水量<2%，穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。
 

　　六、實(shí)時監(jiān)測與數(shù)據(jù)分析：閉環(huán)優(yōu)化
 

　　UV監(jiān)測脫保護(hù)
 

　　化多肽合成儀記錄每步脫保護(hù)的UV吸光度變化，生成脫保護(hù)效率曲線。
 

　　凱撒測試(茚三酮測試)
 

　　取10-15個樹脂珠，加入茚三酮試劑后110℃加熱5分鐘，通過顏色變化判斷偶聯(lián)完成度。
 

　　數(shù)據(jù)記錄與報告
 

　　詳細(xì)記錄試劑用量、反應(yīng)時間、溫度、壓力等參數(shù)，生成實(shí)驗(yàn)報告。
 

　　案例：某企業(yè)通過引入AI算法分析歷史數(shù)據(jù)，預(yù)測合成難點(diǎn)(如β-分支氨基酸區(qū)域)，提前調(diào)整反應(yīng)條件，使合成周期縮短40%。